現(xiàn)代生物技術(shù)，尤其是合成生物學(xué)的快速發(fā)展，使得我們能夠通過(guò)基因改造賦予植物新的性狀。植物基因組的精確修飾可以通過(guò)同源重組或基因編輯實(shí)現(xiàn)，而新基因也可以通過(guò)隨機(jī)整合的方式導(dǎo)入植物基因組。然而，在高等植物中，通過(guò)同源重組進(jìn)行基因靶向（gene targeting）修飾的效率通常極低，這成為精確修飾植物基因組的主要障礙之一。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA隨機(jī)整合到植物基因組是一種常用的基因?qū)牍ぞ?，但篩選轉(zhuǎn)基因植物需要使用選擇標(biāo)記（selection marker），而公眾對(duì)選擇標(biāo)記可能對(duì)人類(lèi)健康造成的潛在風(fēng)險(xiǎn)表示擔(dān)憂(yōu)。目前，歐盟超過(guò)一半的國(guó)家已正式禁止轉(zhuǎn)基因（genetically modified）作物的種植。因此，開(kāi)發(fā)無(wú)選擇標(biāo)記的DNA導(dǎo)入技術(shù)對(duì)于安全轉(zhuǎn)基因應(yīng)用具有重要意義，相關(guān)研究也備受關(guān)注。盡管已有多種策略被探索，如共轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)座元件和位點(diǎn)特異性重組等，但這些方法通常操作繁瑣且效率不高。

2025年2月5日，Plant Direct在線(xiàn)發(fā)表上海師范大學(xué)王水團(tuán)隊(duì)題為“Delivery of Marker-Free DNA to Plant Genome by the Transgenic Selection-Associated Fragment Elimination (T-SAFE) System”的研究論文。該研究成功建立了一種簡(jiǎn)單、高效且安全的方法，能夠向植物基因組遞送大片段DNA（>10 kb），為植物基因改造提供了新的技術(shù)手段。

該研究開(kāi)發(fā)了一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)的簡(jiǎn)化高效系統(tǒng)，稱(chēng)為T(mén)ransgenic Selection-Associated Fragment Elimination （T-SAFE）系統(tǒng)（圖1）。T-SAFE系統(tǒng)由四個(gè)模塊組成：選擇標(biāo)記、CRISPR/Cas9、間隔序列加原間隔序列相鄰基序（SP）和遞送的DNA。其中，選擇標(biāo)記和CRISPR/Cas9模塊合稱(chēng)為SCC。SCC兩側(cè)是兩個(gè)源自果蠅Ebony基因的相同SP（SP-F和SP-R，序列方向相反），這些序列能夠在外源DNA整合到植物基因組時(shí)，有效引導(dǎo)Cas9切割包含選擇標(biāo)記基因的SCC，從而實(shí)現(xiàn)選擇標(biāo)記的自我消除。此外，為了抑制細(xì)菌中功能性Cas9蛋白的產(chǎn)生，研究團(tuán)隊(duì)將馬鈴薯ST-LS1基因的IV2內(nèi)含子整合到Cas9基因中；同時(shí)，為了避免在非生殖植物細(xì)胞中發(fā)生SCC切割，Cas9基因由生殖細(xì)胞特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。這些創(chuàng)新設(shè)計(jì)使T-SAFE系統(tǒng)在擬南芥轉(zhuǎn)基因植物中選擇標(biāo)記的消除效率達(dá)到10-30%，在水稻中達(dá)到5-8%，且DNA遞送能力超過(guò)10 kb。這一方法為植物基因改造提供了一種安全可靠的新途徑。

T-SAFE系統(tǒng)示意圖

（A）T-SAFE系統(tǒng)由四個(gè)模塊組成：選擇標(biāo)記（selection marker）、CRISPR/Cas9、SP（SP-F和SP-R，序列方向相反）和遞送的DNA（Cargo）。（B）DNA整合到植物基因組后，sgRNA引導(dǎo)Cas9有效切割SCC兩端的SP。（C）自我消除SCC后，無(wú)選擇標(biāo)記的目標(biāo)DNA成功地送到植物基因組。引物對(duì)F1/C-R和F2/C-R分別用于檢測(cè)植物中整合片段是否含有SCC。采用TAIL-PCR擴(kuò)增整合片段側(cè)翼的植物基因組序列。根據(jù)TAIL-PCR結(jié)果，設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物PG-F/C-R和PG-F/PG-R，用于鑒定基因組DNA片段與SCC切割后的目標(biāo)DNA片段的整合情況。

上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院卓越創(chuàng)新班本科生楊奕為論文第一作者，王水研究員為通訊作者。實(shí)驗(yàn)室研究生常歡、潘鐳文、郭東北、彭順、毛婷和張悅慧等同學(xué)參與了本項(xiàng)研究。相關(guān)工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委和上海市植物種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心等項(xiàng)目的資助。

（供稿、圖片：生命科學(xué)學(xué)院）